Rambler's Top100

Курс "ОСНОВЫ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ИНЖЕНЕРИИ"

 

Программу составил: д.б.н. Патрушев Л.И..

1. Предмет и задачи генной инженерии. Основоположники генной инженерии В.Арбер, Д.Натане, Х.Смит, П.Берг, У.Гилберт, Ф.Сенгер.

1.1. Ферменты, используемые в генной инженерии. Рестриктазы. Номенклатура и классификация. Рестриктазы I, II и III типов. Формы разрывов двухцепочечных ДНК, возникающих под действием рестриктаз. Механизм реакции, катализируемой рестриктазой ЕсоRI. Изошизомеры. Изменение субстратной специфичности рестриктаз в неоптимальных условиях. ДНК-метилазы. Использование для получения крупных рестрикционных фрагментов ДНК. ДНК-лигазы. Механизм лигирования ДНК Т4-ДНК-лигазой. РНК-лигаза бактериофага Т4. ДНК-зависимая ДНК-полимераза I Е.сoli и фрагмент Кленова. Использование для введения концевой радиоактивной метки, "затупления" концов ДНК и ник-трансляции. Термостабильные ДНК-зависимые ДНК-полимеразы. РНК-зависимые ДНК-полимеразы (обратные транскриптазы), использование для получения кДНК. Применение полинуклеотидкиназы для введения концевой радиоактивной метки. Терминальная трансфераза. Использование для синтеза коннекторов. Щелочные фосфатазы. Применение для повышения эффективности клонирования. Нуклеазы в генной инженерии. Экзонуклеаза III Е.соli . Экзонуклеаза фага ламбда. S1-нуклеаза. РНКаза А и ДНКаза I.

1.2. Этапы клонирования ДНК. Понятие вектора и его емкости. Функциональная классификация векторов: экспрессирующие векторы, челночные (бинарные) векторы. Особенности строения плазмидных векторов на примере полифункционального вектора Вluescript. Полилинкер. Селектируемые маркеры. Ген lасZ в качестве селектируемого маркера. Векторы на основе фага ламбда. Космиды, фазмиды и фагмиды. Сверхъемкие векторы YАС, ВАС и РАС. Клонирование фрагментов ДНК по сайтам рестрикции, а также с использованием адаптеров и коннекторов. Системы регулируемой экспрессии рекомбинантных генов.

1.3. Библиотеки и клонотеки кДНК, генов и нуклеотидных последовательностей. Репрезентативность. Способы введения ДНК в клетки: трансформация, трансфекция, электропорация. Получение библиотек ЕТS-последовательностей. Вычитающая гибридизация. Методы скрининга библиотек и клонотек ДНК. Гибридизация с зондами. Использование ПЦР. Бесклеточные белок-синтезирующие системы. Дифференциальный дисплей. Стратегии выделения новых генов и оптимизации их экспрессии.

1.4. Исследование экспрессии генов. Нозерн-блоттинг. Защита мРНК от действия РНКаз. Анализ регуляторных последовательностей ДНК. Микрочипы и микроматрицы ДНК. Методы RDA и SAGE. Методы быстрой амплификации концов кДНК (RACE). Исследование белок-белковых взаимодействий в дигибридных дрожжевых системах. Футпринтинг. Микрофлюидика.

1.5. Подходы к анализу больших геномов. Две стратегии построения физических генетических карт: картирование сверху вниз и снизу вверх. Физические карты низкого и высокого разрешения. Рестрикционные карты и их построение. Гибридизация по Саузерну. "Прогулки и прыжки по хромосомам". Концепция STS-маркеров. Контиги. Компьютерный анализ нуклеотидных последовательностей. Электронная ПЦР. Геномика и протеомика.

2. Предмет и задачи белковой инженерии. Две стратегии получения новых белков: рациональный редизайн и направленная эволюция. Синтез пептидов и белков. Комбинаторные подходы к синтезу пептидов. Фаговый дисплей. Полипептидный дисплей. Полисомные библиотеки. Пептидные аптамеры. Принципы создания искусственных белков с требуемыми свойствами. Способы направленного введения мутаций в гены. Получение точечных мутаций, делеций и вставок с помощью ПЦР. Включение неприродных аминокислот в белки с помощью тРНК. Использование поперечных сшивок в стабилизации ферментов. Экстремозимы. Изменение субстратной специфичности ферментов и специфичности рецепторов в отношении лигандов. Субтилигаза. Гибридные белки и токсины. Рекомбинантные антитела. ДНК-вакцины.

3. Антисмысловые олигонуклеотиды и РНК. Использование для регуляции экспрессии генов. Механизмы подавления экспрессии генов антисмысловыми олигонуклеотидами. Олигонуклеотидные аптамеры. Методы скрининга. Примеры использования аптамеров в современной биотехнологии. Ферментативная активность РНК. Методы отбора рибозимов с требуемыми свойствами. Использование рибозимов для репарации мРНК. Дезоксирибозимы.

4. Трансгенные животные и растения и способы их получения. Свойства. Использование в биотехнологии.

5. Проблема биобезопасности при проведении генно-инженерных работ.

 

Рекомендуемая литература

 

  1. Л.И.Патрушев. Экспрессия генов. М., Наука, 2000.
  2. В.Н.Рыбчин. Основы генетической инженерии. СПб., СПбГТУ. 1999.
  3. Е.Д.Свердлов. Очерки современной молекулярной генетики по курсу лекций для студентов биологического факультета МГУ. Очерк 5. Трансгеноз и новая молекулярная генетика. Молекулярн. генетика, микробиология и вирусология, 1996. № 4. С. 3-32.
  4. Е.Д.Свердлов. Очерки современной молекулярной генетики по курсу лекций для студентов биологического факультета МГУ. Очерк 6. Гемотерапия и медицина XXI века. Там же. 1997. № 2. С. 3-28.
  5. Е.Д.Свердлов. Очерки современной молекулярной генетики по курсу лекций для студентов биологического факультета МГУ. Очерк 7. Болезни генома и новая молекулярная генетика. Часть 1. Там же. 1998. №1.С. 3-29.
  6. Е.Д.Свердлов. Очерки современной молекулярной генетики. Очерк 8. Болезни генома и новая молекулярная генетика. Часть 2. Рак - болезнь генома. "Гены рака" и передача сигнала в клетке. (Начало лекции). Там же. 1999. №2. С. 3-22.
  7. Е.Д.Свердлов. Очерки современной молекулярной генетики. Очерк 8. Болезни генома и новая молекулярная генетика. Часть 3. Рак - болезнь генома. Транскрипция и рак. (Начало лекции). Там же. 2000. № 1. С. 3-11.
  8. Е.Д.Свердлов. Очерки современной молекулярной генетики. Очерк 8. Болезни генома и новая молекулярная генетика. Часть 3. Рак - болезнь генома. Транскрипция и рак. (Окончание лекции). Там же. 2000. №2. С.3-30.
  9. М.Сингер, П.Берг. Гены и геномы. М., Мир, 1998.