Кафедра физико-химической биологии и биотехнологии ФБМФ МФТИ
Rambler's Top100
Физтех-ПорталСхема проездаФорумCайт ИБХCайт ФМБФДругой сайт кафедрыНаписать письмо
 Поиск
 Разделы сайта

 Голосование
В какой форме стоит осуществлять общение 3 курса с администрацией кафедры?

лучше провести встречу, а только потом экскурсию по лабораториям
опубликовать интервью на сайте, а в ИБХ только показывать лаборатории
другое (а что именно, напишите нам в письме)

Результаты
Архив голосований
 Материалы сервера
Версия для печати

Практикум "ХИМИЯ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ И ОСНОВЫ ГЕННОЙ ИНЖЕНЕРИИ"


Составители: к.х.н. Завада Л.Л., к.х.н. Филиппова Л.Ю.

 

Работа  № 1 - 18 часов. Плазмиды в Escherichia coli.

1.1.   Способы консервирования и хранения клеточных культур. Получение клеточной суспензии E.coli в среднелогарифмической фазе роста. Спектрофотометрический контроль роста клеток. Приготовление компетентных клеток. Векторы. Способы внедрения векторных молекул в клетки E. coli . Трансформация компетентных клеток плазмидным шатл-вектором pIGDAch. Рассев культуры и анализ полученных клонов.

1.2.   Тиражирование ДНК. Приготовление ночной культуры E. coli , содержащей плазмидную ДНК, с селекцией по устойчивости к антибиотику.

1.3.   Метод щелочного лизиса, особенности поведения плазмидной ДНК. Лизирование клеток ночной культуры и выделение плазмидной ДНК полупрепаративным методом.

1.4.   Отделение плазмид от РНК и белков. Электрофоретический анализ плазмидной ДНК в полиакриламидном геле и агарозе. Способы визуализации нуклеиновых кислот. Количественная оценка полученной плазмидной ДНК.

Работа № 2 - 18 часов. Анализ трансформированных дрожжевых штаммов на присутствие шатл-векторов E. coli/ Saccharomyces cerevisiae.

2.1.   Подготовка минимальной среды YNB для роста дрожжевых клеток. Приготовление ночной культуры клеток штамма DC-5 S. cerevisiae c трансформированным экспрессирующим шатл-вектором. Спектрофотометрический контроль роста клеток.

2.2.   Выделение и очистка суммарной ДНК. Подготовка ДНК к трансформации в E. coli. Трансформация компетентных клеток E. coli штамма JM-109 суммарной ДНК. Определения эффективности компетентных клеток.

2.3.   Анализ клонов ДНК для определения размера плазмид. Приготовление ДНК маркера.

2.4.   Расщепление плазмидной ДНК рестриктирующеми эндонуклеазами. Электрофорез в агарозном геле с последующим анализом результатов.

Работа № 3 - 12 часов. Полимеразная цепная реакция (ПЦР).

3.1.   Приготовление реакционной смеси для проведения ПЦР. Особенности проведения реакции амплификации с использованием колоний клонов или плазмидной ДНК в растворе. Освоение навыков программирования амплификатора.

3.2.   Разделение продуктов ПЦР в агарозном геле. Визуализация с помощью бромистого этидия.

Работа № 4 - 6 часов. Синтез и очистка олигонуклеотидов, используемых в качестве праймеров для ПЦР.

4.1.   Методы олигонуклеотидного синтеза: фосфатный, H-фосфанатный. Ознакомление с принципами работы автоматического синтезатора ASM-102U (BIOSSET, Россия) с использованием фосфоамидитного метода синтеза.

4.2.   Методы очистки олигонуклеотидов с помощью электрофореза и хроматографии.

Работа № 5 - 12 часов. Сиквенирование ДНК.

5.1.   Техника безопасности при работе с радиоактивными изотопами фосфора. Правила работ в изотопном блоке.

5.2.   Полимеразы, используемые для сиквенирования ДНК ферментативным методом по Сенгеру. Постановка реакции по методу Сенгера.

5.3.   Электрофоретическое разделение продуктов реакции в денатурирующих условиях. Получение и проявления радиоавтографа. Правила чтения последовательности нуклеотидов.

 Рекомендуемая литература

  1. Ю.А. Овчинников. Биоорганическая химия. М., Просвещение, 1987.
  2. А.Б. Вартапетян. Полимеразная цепная реакция (обзор). Молекулярная биология. 1991. Т.25, вып.4. С. 926-936.
  3. А.В. Черемис, Э.Д. Ахунов, В.А. Вахитов. Сиквенирование ДНК. М., Наука, 1999.
  4. Т. Маниатис, Э. Фрич, Дж. Сэмбук. Молекулярное клонирование. М., Мир, 1986.
  5. Д. Льюин. Гены. М., Мир, 1984.
  6. Дж. Уотсон, Дж. Туз, Д.Курц. Рекомбинантные ДНК. М., Мир, 1986.
  7. Л.И. Патрушев. Экспрессия генов. М., Наука, 2000.
  8. М. Сингер, П. Берг. Гены и геномы. М., Мир, 1998.
  9. Клонирование ДНК. Методы. Под ред. Д. Гловера. М., Мир, 1988.
Назад:
Курс "ОСНОВЫ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ИНЖЕНЕРИИ"
Далее:
Курс "ЛИПИДЫ И МЕМБРАНЫ"

наверх | на главную
 Discuss it
Add your comment
Author
Subject
Message
  • О сайте (Инна [80.251.112.200], 07.02.2013 08:23:05) #
    А нельзя ли всё это выпустить монографией и продавать в Академкниге. Я фармацевт и мне это было бы очень интересно, например, как получают ферменты для применения в медицине и какие. Спасибо.